La película comienza con una secuencia de acción en la que Woody, Jessie, tiro al blanco y Buzz se ven en la obligación de detener los planes del malvado Mr. Potato Head, quienes para la fecha se han aliado con el malvado Dr. Hamm y el trío de marcianos, conformando un grupo de villanos que reducen los héroes, a pesar de las diferentes habilidades de los personajes.
Once años después de lo sucedido en Toy Story, Andy, de diecisiete años de edad, se prepara para ir a la universidad. Woody, Buzz Lightyear y el resto de los juguetes se preocupan por un futuro incierto puesto que deben aceptar la dolorosa realidad de que su dueño Andy ya no es un niño y que ha dejado de jugar con ellos desde hace mucho tiempo, algunos amigos de Buzz y Woody ya no están con ellos debido a accidentes, mercadillos y pérdidas. Por si fuera poco, las cosas se intensifican tan pronto la madre de Andy empieza a organizar una nueva donación, esta vez con destino a Sunnyside, una guardería, ofreciéndole tanto a Andy como a Molly que donen unos juguetes suyos. Mientras que Molly empaca unos cuantos juguetes musicales y a su Barbie. Por otra parte, Andy escoge de entre todos sus juguetes a Woody para llevarlo a la universidad con él, y empaca al resto en una bolsa de basura para confinarlos en el ático.
Sin embargo, justo cuando Andy se encontraba cerca de guardar sus juguetes, el muchacho se ve en la obligación de ayudar a su hermanita menor a empacar, dejando la bolsa sola. Provocando que su madre, ignorante de esto, crea que la bolsa es basura y desecha a los juguetes, acrecentando la paranoia del grupo de juguetes los cuales toman la decisión de marcharse a la guardería tan pronto escapan de la bolsa. Woody consigue llegar con el grupo e intenta informarles de la terrible equivocación que se produjo. Sin embargo los juguetes, convencidos erróneamente de que su dueño ya no los quiere, se introducen en la caja de Sunnyside obligando al vaquero a ir con ellos hasta la guardería.
Una vez en la guardería los juguetes de Andy reciben una calurosa bienvenida por parte de los juguetes de Sunnyside, liderados por el oso Lotso. Los juguetes de Andy se convencen inmediatamente de su nuevo hogar, debido a que generaciones y generaciones de niños estarán jugando con ellos, viviendo sin la preocupación de ser desechados. Woody, por su parte, no se siente cómodo y continúa insistiendo en que le pertenecen a Andy y deberían regresar con él. Los otros insisten en quedarse, por lo que Woody decide abandonarlos y regresar solo junto a Andy. Poco después de que Woody se vaya, los demás juguetes descubren que los niños que Lotso les había asignado en el salón orugas para que jugaran con ellos son muy pequeños e hiperactivos, razón por la cual al jugar con ellos los maltratan hasta un grado que parecen ser torturados y deteriorados hasta su máxima resistencia.
Más tarde indignado por la situación, Buzz va a ver a Lotso pero encuentra a Ken y a otros juguetes apostando al póquer usando baterías, piezas y dinero de monopoly como si de asuntos monetarios se tratase, Al ver esta delicada situación y ser atrapado por Ken y los demás juguetes, Buzz, proclamado como cabeza de familia, decide confrontar a Lotso para una reubicación al salón mariposas, plagado de niños “mayores”. Sin embargo, durante el progreso, Buzz se concentra en el resto de los juguetes del salón mariposa descubriendo que se tratan de unos egoístas y malvados juguetes, los cuales le desean lo peor a los juguetes de Andy, luego lo atan a una silla para reprogramarlo de nuevo como guardián espacial, con el fin de vigilar a los juguetes debido a la fuga de Woody y a la decisión que los juguetes acaban tomando de regresar con Andy.
Mientras tanto, Woody que no consiguió llegar muy lejos cuando una niña, aficionada de los juguetes, llamada Bonnie lo encuentra y se lo lleva a su casa. Esa noche Woody consigue con la ayuda de los juguetes de Bonnie ubicar la casa de Andy que está muy cerca y cuando está a punto de ir de regreso los juguetes en especial el Payaso le revelan a Woody que Sunnyside es en realidad una prisión de juguetes, controlada despóticamente por Lotso, quien se había vuelto amargado y malvado después de que su dueña lo había perdido por accidente y reemplazado por otro oso de peluche similar a él, habiéndola abandonado después de reprimir enérgicamente a bebé grande y dejando atrás a Payaso quien también era juguete suyo y fue rescatado por Bonnie en tiempos recientes. Dándose cuenta de que sus amigos corren peligro, Woody decide regresar a rescatarlos. De regreso en la guardería, los otros juguetes se dan cuenta de que Woody tenía razón y Andy los quiere después de todo, cuando Mrs. Potato Head lo ve buscándolos desesperadamente a través de uno de sus ojos, que había perdido en la casa de Andy, el cual seguía estando su habitación. Poco después, Lotso y sus juguetes secuaces (entre los que se encuentra Buzz, manipulado por Lotso) colocan a los juguetes de Andy en canastas que para ellos son como celdas. Al día siguiente, Woody regresa a Sunnyside y se encuentra con telefonito quien le relata los pormenores de como poder escapar y sus dificultades, al mismo tiempo logra reunirse con sus amigos, y todos juntos formulan un plan para escapar de la guardería y regresar a su casa antes de que Andy se fuera a la universidad. Durante su escape, atrapan a Buzz y tratan de volverlo a la normalidad, pero accidentalmente lo configuran para el idioma español desarrollando una personalidad que no corresponde con la suya, provocando que se enamore de Jesie.6
Luego de un plan muy complejo ideado por Woody, en donde se ponen en práctica todas las habilidades de los juguetes, éstos consiguen llegar a una puerta para la basura, pero Lotso y sus secuaces los interceptan. Los juguetes de Andy señalan que Lotso usa a los juguetes de Sunnyside sólo porque había sido reemplazado y Woody le dice a Lotso la verdad de su dueña; oyendo esto, sus secuaces cambian de opinión y el Bebé arroja a Lotso al basurero, salvándose Ken y Barbie. Sin embargo un marcianito se atoró en la tapa del contenedor de la basura, y al intentar ayudarlo Woody es jalado por Lotso a la basura. Los juguetes de Andy van a su rescate, y un camión recolector de basura los atrapa. En el camión, a Buzz le cae encima un televisor por salvar a Jessie, y el golpe lo vuelve a la normalidad. Los juguetes son llevados a un basurero y en el momento de llegar, el trío de marcianitos verdes de "Pizza Planet" es arrastrado por un camión gigante. El grupo, luego de observar a sus amigos irse, cae arrastrado por otro camión a un agujero en el suelo, allí una placa móvil de metal lleva a los juguetes a una trituradora, desesperados observan que los objetos metálicos se "salvan" de la trituradora, pero llegan a una nueva placa metálica que los conduce a una fundición para reciclaje del metal. Encuentran a Lotso y lo salvan de destruirse en la trituradora, pero en la fundición, después de auparlo para alcanzar el interruptor, éste los traiciona y huye sin ayudarlos.
A pesar de sus desesperados intentos de salir del lugar, cuando están cayendo directo hacia el fuego, no pueden ya seguir luchando, entonces los juguetes se toman de las manos rendidos, listos para ser incinerados. Sin embargo, afortunadamente, los muñecos de extraterrestres verdes manipulan una garra gigante de metal, con la que logran sacar a los juguetes del horno y colocarlos a salvo; indignados por lo que les hizo Lotso lo buscan para poder ajustar cuentas, pero Woody sugiere no hacerlo ya que según él "no vale la pena". Mientras tanto, uno de los trabajadores del basurero encuentra a Lotso quien trataba de escapar temeroso de los otros juguetes que traicionó, entonces lo ata al frente de su camión, para gran descontento suyo mientras otros ya atados le dan la bienvenida al lugar horrible.
Los juguetes se esconden en otro camión de basura, que los lleva de regreso a la casa de Andy. Allí, éste los encuentra; los juguetes ya listos para ir al ático se comienzan a despedir de Woody mientras el entra a la caja de la universidad, sin embargo, pensando mejor la situación decide que él y sus amigos juguetes merecen un destino mejor que ser confinados en el ático, por lo que le deja una nota a su dueño con la dirección de la casa de Bonnie. Andy empieza a regalar sus juguetes a Bonnie, pero ésta encuentra a Woody y cuando está a punto de agarrarlo, Andy se lo niega, luego de observarlo unos cuantos segundos, se lo presenta de la misma forma como presentó al resto de los juguetes, y se lo regala.
Andy juega por última vez con sus juguetes y con Bonnie y se despide diciendo "Gracias chicos". Woody lo ve irse, no sin antes decirle a Andy "Adios vaquero", luego entra a la casa de su nueva dueña junto a Buzz, Jessie, Bullseye, Slinky, Rex, Hamm, los marcianitos y el matrimonio Potato Head.
En los créditos se muestra que mientras todo es feliz para Woody y compañía en su nuevo hogar, los juguetes de Sunnyside transforman la guardería en un lugar agradable, ya libres de Lotso. Con Ken y Barbie al mando han transformado el lugar en todo un sitio de retiro digno para juguetes donados o abandonados, los cuales reciben una atención excepcional desde una bienvenida calurosa en ambos salones, hasta verlos trabajando en equipo para mantener a los niños ocupados y recibiendo atenciones dignas de un Spa. Mantienen al tanto a Woody y sus amigos a través de cartas de su nuevo amigo Ken y de su anterior compañera Barbie, de la misma manera Payaso recupera su sonrisa y los soldaditos de juguete que alguna vez huyeron de casa de Andy ahora también están en SunnySide encargándose de la protección y vigilancia.
En la parte final Buzz y Jessie bailan la nueva versión en flamenco de la banda sonora principal de la película "Hay un amigo en mí".
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